Previas a la ImmunoHistoQuímica

Así a groso modo, la ImmunoHistoQuímica (IHQ) es una técnica utilizada en laboratorio para identificar y localizar de forma específica moléculas en diferentes clases de tejidos y/o células, aprovechando la reacción de unión antígeno-anticuerpo.

Pero ¿qué debemos tener en cuenta antes de empezar la técnica?

1. ¿En qué parte de la célula se encuentra la molécula que busco: membrana, citoplasma o núcleo? Si se encuentra en el núcleo, lo más probable es que debamos permeabilizar el tejido o célula; si se encuentra en la membrana, jamás deberemos hacerlo, y si está en el citoplasma, puede que debamos permeabilizar, aunque lo habitual es que no se deba hacer. La solución más utilizada para permeabilizar es PBS con un 0.05% deTriton X100 durante 5-10 minutos. Ah, y para los más despistados debéis saber que permeabilizar es hacer pequeños poros en la célula para que pueda penetrar el anticuerpo y poder así detectar la molécula que buscamos.

2. ¿Qué solución utilizo para bloquear uniones inespecíficas? Lo habitual es añadir al tampón de lavado un suero fetal a un 3-20%. La especie que escojamos dependerá de la de los anticuerpos que utilicemos, de manera que debemos escoger un suero fetal de diferente especie que la de nuestro anticuerpo primario, para así no bloquear los puntos de unión de éste, y se recomienda que sea de la misma especie en que se haya obtenido el secundario, para evitar uniones inespecíficas de este segundo anticuerpo. Así, por ejemplo, si nuestro primario está hecho en Ratón y el secundario en Cabra, tendremos que preparar nuestra solución de bloqueo de uniones inespecifícas con suero fetal de Cabra.

3. ¿Necesito desenmascarar los antígenos? El enmascaramiento de los antígenos se produce porque se tras la fijación del tejido con formol, PFA, …, se forman unos puentes de aldehídos impiden que el anticuerpo primario se una a su antígeno, por no poderlo reconocer, dando lugar a un falso negativo. Este enmascaramiento se puede deshacer por varias técnicas, que son HIER (Heat-induced epitop retrieval) o PIER (Protease-i nduced epitop retrieval); en el primer caso, aplicamos calor a un tampón de una sales y un pH concreto, mientras que en el segundo caso, se aplica calor a una proteasa. Pero cuidado, porque no siempre es necesario este paso, pues puede que los puentes de aldehídos no se formen o no acaben de enmascarar el antígeno, y entonces al aplicar algunos de los retrievals lo que hagamos en realidad sea romper  nuestro antígeno. Por tanto, yo recomiendo primero probar la immunohistoquímica sin hacer ningún desenmascaramiento, y si  no sale, probaría HIER con Citrato 10mM pH6. En caso de seguir saliendo negativo,  miraría otras posibilidades con HIER, y como última opción, las posibilidades con PIER, por ser las más delicadas de todas.

4. ¿Qué anticuerpo secundario escojo? Pues primero debes mirar qué quieres que tenga conjugado,  una enzima (HRP, Fostasa Alcalina, Biotina) o un fluorocromo (Alexa, Cianina, DyLight, QDot). La ventaja de escoger una enzima es que la tinción perdura para siempre y para analizar el resultado sólo necesitas un microscopio de luz blanca, pero alarga mucho el protocolo y suele ser necesaria la inhibición del enzima que pueda estar presente en el tejido de forma endógena; sin embargo, el uso de fluorocromos hace que el protocolo sea más corto  y permiten combinar colores de marcaje más fácilmente, pero hay que tener en cuenta que la fluorescencia se apaga y que se necesita un microscopio apto para fluorescencia con láseres capaces de excitar rojos, verdes y ultravioletas. Lo segundo que debes mirar es la especie en que contra la que va, que debe ser la misma que la que se ha hecho el primario.

5. ¿Cómo se interpretan las especies de un anticuerpo? Primero se especifica la especie en que se ha obtenido y después contra la que reacciona. Por ejemplo, el anticuerpo “Mouse anti-human CD3” nos dice que es un anticuerpo producido en ratón que reacciona contra la molécula CD3 humana. Así, este anticuerpo sólo se puede usar en tejido humano, y se utilizará un anticuerpo secundario anti ratón.

Bueno, y como ya se está haciendo muy largo, lo dejo aquí. Si alguien necesita alguna aclaración más, o tiene dudas, que me lo deje en comentarios.

Gracias y hasta la próxima!

PBS

PBS son las siglas de Phosphate Buffered  Saline, una solución imprescindible para cualquier laboratorio.

Es un tampón isotónico que gracias a los fosfatos, mantiene estable el pH, y como por su composición no es tóxico para las células, tiene diversos usos en el laboratorio: diluir otros reactivos, lavados de células y tejidos en diferentes técnicas,…

Lo podemos encontrar en varios formatos: ya listo para usar, 10 veces más concentrado (sólo lo debemos diluir), en sobre o pastillas listos para verter en el volumen de agua indicado, etc. Pero cuanto más “masticado” nos lo den, más caro es el producto, y si lo pensamos, simplemente se trata de mezclar una cantidad concreta de sales específicas en un volumen determinado de agua y ajustar el pH para acabar.

Nosotros, la verdad es que si es para utilizar en cultivos celulares, lo compramos “ready to use”, más que nada por esterilidad y estandarizar su composición, pero si es para “uso de batalla”,  nos lo preparamos nosotros mismos 10 veces más concentrado, y lo diluimos cuando lo vayamos a usar, de manera que el laboratorio siempre hay una botella de 1 litro PBS 10x que usamos para preparar una garrafa de 10 litros de 1x, y de aquí nos vamos sirviendo cada uno.

Así, para preparar 1 litro de PBS 10x necesitamos:

14.4  gr Na₂HPO₄  (fosfato disódico)

2.2 gr KH₂PO₄ (fosfato de potasio)

2 gr KCl (cloruro potásico)

80 gr NaCl (cloruro sódico)

El pH debe estar entre 7.2 y 7.4.

Procederemos así:

- En un vaso de precipitado de 1 litro, pondremos ±800 ml de H₂O (destilada, milliQ)

- Vertemos las 4 sales en el vaso, introducimos una mosca magnética y dejamos el vaso en un agitador magnético hasta que las sales estén completamente disueltas.

- Comprobamos el pH; suele estar a 6.7, así que lo ajustamos con NaOH 2M (hidróxido sódico, sosa) hasta 7.4

- Verter la disolución en una probeta y enrasar hasta 1 litro.

Para preparar 1 litro de PBS 1x, o lo que es lo mismo “ready to use”, diluimos 100 ml de PBS 10x en 900 ml de H₂O, mezclamos bien y ya está.

Tanto el 10x como el 1x se conservan a temperatura ambiente en perfectas condiciones.

Y ya está! Es algo sencillo, pero útil, no?

Hasta pronto!

Immunofenotipado, diferentes procedimientos técnicos

Hola!

El objetivo del immunofenotipado es marcar con un fluorocromo nuestras células, para luego pasarlas por un citómetro de flujo que cuantifica, célula por célula, su tamaño, forma, fluorescencia, …

El resultado lo vemos en forma gráficos: eje de coordenadas e histograma; el eje nos indica el tamaño y complejidad de la célula mediante nube de puntos, mientras que el histograma nos da un área (normalmente en forma de pico), y nos muestra la intensidad de la señal que dan nuestras células. Todo esto nos ayuda a interpretar los resultados pudiendo diferenciar nuestras células en poblaciones, subpoblaciones, etc.

Pero no quiero hablar sobre la técnica en sí, sino en la manera de procesar las muestras.

Debemos tener en cuenta que cada citómetro tiene unos tubos determinados donde poner nuestra muestra a la hora de su lectura, pues el aparato debe presurizar correctamente para aspirar las células y pasarlas por los conductos que correspondan.

Entonces, parece lógico efectuar todo el procesamiento en éstos mismo tubos, pero ¿qué hacer cuando tenemos muchas muestras? ¿Qué alternativas tenemos? ¿Qué ventajas y desventajas tienen  cada una de ellas?

1. Procesar las muestras en placa de 96 pocillos de fondo cónico o redondo.

Las ventajas son:

- rapidez, procesas muchas muestras a la vez

- te puedes ayudar de pipeta multicanal para lavados, repartir células y anticuerpos, etc

- comodidad, necesitas muy poco espacio

Pero también presenta varias desventajas:

- lavados de 200µl/pocillo es poca cantidad, así que tienes que hacer varias rondas, por lo menos 3.

- debes tener un a centrífuga para placas

- gastas puntas y reservorios

- antes de leer las células debes pasarlas a tubos de citometría, lo que conlleva mucho riesgo de error porque puedes confundirte tubo

2. Procesar las muestras en microtubos 1.5 ml (tipo eppendorf).

Las ventajas son:

- comodidad, son tubos fáciles de transportar

- lavados rápidos

- rapidez  relativa

Y como desventajas tenemos:

- abrir y cerrar los tubos hace perder tiempo

- lavados de 1.5ml es justito

- antes de leer las células debes pasarlas a tubos de citometría

Yo lo he procesado de las tres maneras, tubos de citometría, microtubos y placas, y me quedo con la primera opción. ¿Por qué?

- Aunque es muy pesado poner y sacar los tubos de la centrífuga,  no tienes que hacer ningún trasvase al final.

- No ahorras nada de reactivo haciéndolo con placas ni microtubos; en los todos  casos pones la misma cantidad de células y el mismo volumen de anticuerpos (primarios, secundarios),  estreptavidinas, …

- En placa y microtubos gastas más material fungible, empezando porque igualmente necesitarás los tubos para pasar las células por el citómetro; tanto usando placa como microtubo, se utilizan reservorios y muchas más puntas de pipeta que no usarías con los tubos de citometría.

- Los lavados son más limpios con tubos, ya que se usan 3 ml/tubo.

- Cuanto más se manipulen las células, en peores condiciones estarán para leerlas; comparando un mismo marcaje hecho de las tres maneras vi que en placa tenía muchas más células muertas  y las vivas estaban regular, mientras que en el marcaje en microtubo, la intensidad de señal era inferior.

CONCLUSIÓN:

Me quedo con el marcaje en tubos de citometría: no ganas nada de tiempo, mayor viabilidad celular  y mejor señal.

Hasta la próxima! (que seguro no tardaré tanto tiempo, lo prometo jejeje)

Llega el fin del mundo, y yo estaré...

Hola!

Bueno, ya llegó el esperado 21/12/2012!!

¡Qué intriga! ¿Cómo se acabará el  mundo? Quizás descubramos así cómo se extinguieron los dinosaurios, no? jejeje

Aunque, qué más da, si no quedará nadie a quien explicárselo. Volverá a resurgir la vida, encontrarán nuestros huesos fosilizados (y los de los dinos), y volverán a conjeturar sobre cuando nos extinguimos, cómo vivíamos, qué comíamos, cómo era nuestra apariencia, aishh y vuelta a empezar...

Bueno, ¿y qué estaréis haciendo en este momento? Yo tengo programado estar todo el día cortando en el criostato, que pensándolo bien, podría ser peor, no? Prefiero esto a estar haciendo fotos de preparaciones en el microscopio jejeje

¿Y vosotr@s? ¿Qué me decís?

Un saludo! Nos vemos en el infinito y más allá! JAJAJAJAJA

Inyectar y mirar!!

Buenas!

Ayer hicimos en el lab algo espectacular, la verdad que me quedé con la boca abierta!

Por vía intravenosa, inyectamos un anticuerpo conjugado con un fluorocromo (Alexa 488, verde) a un ratón sano. Esperamos 20 minutos y sacrificamos al animal. Se extrajo el órgano de interés, se congeló con OCT y se guardó a -80ºC.

Al día siguiente, se hicieron cortes del  bloque a 5, 8 y 10 um, se fijó el tejido y se montó para observar al microscopio. Así, directamente, tal cual!

Y qué vimos??????? Pues un marcaje en verde de membrana precioso, en la zona esperada, sin backgrounds ni nada por el estilo!!!

 Nada tenía que envidiar a un tejido sin teñir al que se le ha hecho una immunohistoquímica, eso sí, los cortes deben ser gordos, porque a  8 micras no se veía tan claro, y menos todavía a 5.

¿Qué os parece?  A mi, que es increíble, que en tan sólo 20 minutos veas una respuesta del animal "in situ".

Hola!!!!!

Hola a tod@s!

Me he animado a escribir este blog sobre técnicas de laboratorio porque yo misma me he encontrado muchas veces perdida, no he sabido qué hacer ante determinados casos o cómo interpretar los resultados obtenidos.

Ay, sí! Me presento primero, ¿no?

Mi nombre es Adriana. Soy Técnico Superior en Anatomía Patológica y Citología desde el año 2004. Lo cursé en el IES Miquel Martí i Pol, de Cornellà de Llobregat (Barcelona).

Trabajo en el Centre Esther Koplowitz, adscrito al Hospital Clínic y la Universidad de Barcelona (entre otros), como técnico de investigación.

Mi intención con este blog es compartir las técnicas que hago en el laboratorio, hacer consultas, plantear y responder dudas, proponer alternativas, ... en fin, que entre todos podamos tener un espacio donde poder dirigirnos cuando nos encontremos bloqueados y no sepamos qué hacer o no acabemos de entender los protocolos a seguir para cada técnica.

Bueno, pues ahora que me conocéis, os doy la bienvenida y espero que esta herramienta nos sea útil a tod@s.

Ale, pues.....   A pipetear!!!

ADRIANA.