PBS

PBS son las siglas de Phosphate Buffered  Saline, una solución imprescindible para cualquier laboratorio.

Es un tampón isotónico que gracias a los fosfatos, mantiene estable el pH, y como por su composición no es tóxico para las células, tiene diversos usos en el laboratorio: diluir otros reactivos, lavados de células y tejidos en diferentes técnicas,…

Lo podemos encontrar en varios formatos: ya listo para usar, 10 veces más concentrado (sólo lo debemos diluir), en sobre o pastillas listos para verter en el volumen de agua indicado, etc. Pero cuanto más “masticado” nos lo den, más caro es el producto, y si lo pensamos, simplemente se trata de mezclar una cantidad concreta de sales específicas en un volumen determinado de agua y ajustar el pH para acabar.

Nosotros, la verdad es que si es para utilizar en cultivos celulares, lo compramos “ready to use”, más que nada por esterilidad y estandarizar su composición, pero si es para “uso de batalla”,  nos lo preparamos nosotros mismos 10 veces más concentrado, y lo diluimos cuando lo vayamos a usar, de manera que el laboratorio siempre hay una botella de 1 litro PBS 10x que usamos para preparar una garrafa de 10 litros de 1x, y de aquí nos vamos sirviendo cada uno.

Así, para preparar 1 litro de PBS 10x necesitamos:

14.4  gr Na₂HPO₄  (fosfato disódico)

2.2 gr KH₂PO₄ (fosfato de potasio)

2 gr KCl (cloruro potásico)

80 gr NaCl (cloruro sódico)

El pH debe estar entre 7.2 y 7.4.

Procederemos así:

- En un vaso de precipitado de 1 litro, pondremos ±800 ml de H₂O (destilada, milliQ)

- Vertemos las 4 sales en el vaso, introducimos una mosca magnética y dejamos el vaso en un agitador magnético hasta que las sales estén completamente disueltas.

- Comprobamos el pH; suele estar a 6.7, así que lo ajustamos con NaOH 2M (hidróxido sódico, sosa) hasta 7.4

- Verter la disolución en una probeta y enrasar hasta 1 litro.

Para preparar 1 litro de PBS 1x, o lo que es lo mismo “ready to use”, diluimos 100 ml de PBS 10x en 900 ml de H₂O, mezclamos bien y ya está.

Tanto el 10x como el 1x se conservan a temperatura ambiente en perfectas condiciones.

Y ya está! Es algo sencillo, pero útil, no?

Hasta pronto!

Immunofenotipado, diferentes procedimientos técnicos

Hola!

El objetivo del immunofenotipado es marcar con un fluorocromo nuestras células, para luego pasarlas por un citómetro de flujo que cuantifica, célula por célula, su tamaño, forma, fluorescencia, …

El resultado lo vemos en forma gráficos: eje de coordenadas e histograma; el eje nos indica el tamaño y complejidad de la célula mediante nube de puntos, mientras que el histograma nos da un área (normalmente en forma de pico), y nos muestra la intensidad de la señal que dan nuestras células. Todo esto nos ayuda a interpretar los resultados pudiendo diferenciar nuestras células en poblaciones, subpoblaciones, etc.

Pero no quiero hablar sobre la técnica en sí, sino en la manera de procesar las muestras.

Debemos tener en cuenta que cada citómetro tiene unos tubos determinados donde poner nuestra muestra a la hora de su lectura, pues el aparato debe presurizar correctamente para aspirar las células y pasarlas por los conductos que correspondan.

Entonces, parece lógico efectuar todo el procesamiento en éstos mismo tubos, pero ¿qué hacer cuando tenemos muchas muestras? ¿Qué alternativas tenemos? ¿Qué ventajas y desventajas tienen  cada una de ellas?

1. Procesar las muestras en placa de 96 pocillos de fondo cónico o redondo.

Las ventajas son:

- rapidez, procesas muchas muestras a la vez

- te puedes ayudar de pipeta multicanal para lavados, repartir células y anticuerpos, etc

- comodidad, necesitas muy poco espacio

Pero también presenta varias desventajas:

- lavados de 200µl/pocillo es poca cantidad, así que tienes que hacer varias rondas, por lo menos 3.

- debes tener un a centrífuga para placas

- gastas puntas y reservorios

- antes de leer las células debes pasarlas a tubos de citometría, lo que conlleva mucho riesgo de error porque puedes confundirte tubo

2. Procesar las muestras en microtubos 1.5 ml (tipo eppendorf).

Las ventajas son:

- comodidad, son tubos fáciles de transportar

- lavados rápidos

- rapidez  relativa

Y como desventajas tenemos:

- abrir y cerrar los tubos hace perder tiempo

- lavados de 1.5ml es justito

- antes de leer las células debes pasarlas a tubos de citometría

Yo lo he procesado de las tres maneras, tubos de citometría, microtubos y placas, y me quedo con la primera opción. ¿Por qué?

- Aunque es muy pesado poner y sacar los tubos de la centrífuga,  no tienes que hacer ningún trasvase al final.

- No ahorras nada de reactivo haciéndolo con placas ni microtubos; en los todos  casos pones la misma cantidad de células y el mismo volumen de anticuerpos (primarios, secundarios),  estreptavidinas, …

- En placa y microtubos gastas más material fungible, empezando porque igualmente necesitarás los tubos para pasar las células por el citómetro; tanto usando placa como microtubo, se utilizan reservorios y muchas más puntas de pipeta que no usarías con los tubos de citometría.

- Los lavados son más limpios con tubos, ya que se usan 3 ml/tubo.

- Cuanto más se manipulen las células, en peores condiciones estarán para leerlas; comparando un mismo marcaje hecho de las tres maneras vi que en placa tenía muchas más células muertas  y las vivas estaban regular, mientras que en el marcaje en microtubo, la intensidad de señal era inferior.

CONCLUSIÓN:

Me quedo con el marcaje en tubos de citometría: no ganas nada de tiempo, mayor viabilidad celular  y mejor señal.

Hasta la próxima! (que seguro no tardaré tanto tiempo, lo prometo jejeje)