Previas a la ImmunoHistoQuímica

Así a groso modo, la ImmunoHistoQuímica (IHQ) es una técnica utilizada en laboratorio para identificar y localizar de forma específica moléculas en diferentes clases de tejidos y/o células, aprovechando la reacción de unión antígeno-anticuerpo.

Pero ¿qué debemos tener en cuenta antes de empezar la técnica?

1. ¿En qué parte de la célula se encuentra la molécula que busco: membrana, citoplasma o núcleo? Si se encuentra en el núcleo, lo más probable es que debamos permeabilizar el tejido o célula; si se encuentra en la membrana, jamás deberemos hacerlo, y si está en el citoplasma, puede que debamos permeabilizar, aunque lo habitual es que no se deba hacer. La solución más utilizada para permeabilizar es PBS con un 0.05% deTriton X100 durante 5-10 minutos. Ah, y para los más despistados debéis saber que permeabilizar es hacer pequeños poros en la célula para que pueda penetrar el anticuerpo y poder así detectar la molécula que buscamos.

2. ¿Qué solución utilizo para bloquear uniones inespecíficas? Lo habitual es añadir al tampón de lavado un suero fetal a un 3-20%. La especie que escojamos dependerá de la de los anticuerpos que utilicemos, de manera que debemos escoger un suero fetal de diferente especie que la de nuestro anticuerpo primario, para así no bloquear los puntos de unión de éste, y se recomienda que sea de la misma especie en que se haya obtenido el secundario, para evitar uniones inespecíficas de este segundo anticuerpo. Así, por ejemplo, si nuestro primario está hecho en Ratón y el secundario en Cabra, tendremos que preparar nuestra solución de bloqueo de uniones inespecifícas con suero fetal de Cabra.

3. ¿Necesito desenmascarar los antígenos? El enmascaramiento de los antígenos se produce porque se tras la fijación del tejido con formol, PFA, …, se forman unos puentes de aldehídos impiden que el anticuerpo primario se una a su antígeno, por no poderlo reconocer, dando lugar a un falso negativo. Este enmascaramiento se puede deshacer por varias técnicas, que son HIER (Heat-induced epitop retrieval) o PIER (Protease-i nduced epitop retrieval); en el primer caso, aplicamos calor a un tampón de una sales y un pH concreto, mientras que en el segundo caso, se aplica calor a una proteasa. Pero cuidado, porque no siempre es necesario este paso, pues puede que los puentes de aldehídos no se formen o no acaben de enmascarar el antígeno, y entonces al aplicar algunos de los retrievals lo que hagamos en realidad sea romper  nuestro antígeno. Por tanto, yo recomiendo primero probar la immunohistoquímica sin hacer ningún desenmascaramiento, y si  no sale, probaría HIER con Citrato 10mM pH6. En caso de seguir saliendo negativo,  miraría otras posibilidades con HIER, y como última opción, las posibilidades con PIER, por ser las más delicadas de todas.

4. ¿Qué anticuerpo secundario escojo? Pues primero debes mirar qué quieres que tenga conjugado,  una enzima (HRP, Fostasa Alcalina, Biotina) o un fluorocromo (Alexa, Cianina, DyLight, QDot). La ventaja de escoger una enzima es que la tinción perdura para siempre y para analizar el resultado sólo necesitas un microscopio de luz blanca, pero alarga mucho el protocolo y suele ser necesaria la inhibición del enzima que pueda estar presente en el tejido de forma endógena; sin embargo, el uso de fluorocromos hace que el protocolo sea más corto  y permiten combinar colores de marcaje más fácilmente, pero hay que tener en cuenta que la fluorescencia se apaga y que se necesita un microscopio apto para fluorescencia con láseres capaces de excitar rojos, verdes y ultravioletas. Lo segundo que debes mirar es la especie en que contra la que va, que debe ser la misma que la que se ha hecho el primario.

5. ¿Cómo se interpretan las especies de un anticuerpo? Primero se especifica la especie en que se ha obtenido y después contra la que reacciona. Por ejemplo, el anticuerpo “Mouse anti-human CD3” nos dice que es un anticuerpo producido en ratón que reacciona contra la molécula CD3 humana. Así, este anticuerpo sólo se puede usar en tejido humano, y se utilizará un anticuerpo secundario anti ratón.

Bueno, y como ya se está haciendo muy largo, lo dejo aquí. Si alguien necesita alguna aclaración más, o tiene dudas, que me lo deje en comentarios.

Gracias y hasta la próxima!